Real Time PCR Hakkında Bilinmesi Gerekenler

Genetik teknolojisindeki baş döndürücü gelişmeler birçok bilimsel alana ışık tutmaktadır. Ayrıca bu alanda ilerlemek için yüksek spesifite ve sensifiteye sahip yeni metotların geliştirilmesine olan ihtiyaç kaçınılmaz bir duruma gelmiştir.

DNA zincirinin önceden belirlenen bir bölgesini çoğaltmak için kullanılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu moleküler genetik alanında devrim niteliği taşıyan bir yöntemdir. Real-Time PCR ise geleneksel PCR’ın uygulama alanlarını arttırırken PCR’la ilişkili pek çok laboratuvar sorununa çözüm getiren yenilikçi bir metottur. Real-Time PCR yöntemi, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresan sinyalinin ölçülmesiyle, kantitatif sonuç alınabilen bir PCR yöntemidir. Real-Time PCR’ın avantajlarını kısaca şu şekilde açıklayabiliriz.

1- Kısa sürede sonuç almak mümkündür.  Sıcaklık döngülerinin hızlı uygulanması ve floresan okunması aynı cihaz içinde ve aynı tüp içinde gerçekleşmektedir. Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle; agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır.

2- Real-Time PCR pratiktir. Aynı cihaz içerisinde hem çoğaltma işleminin, hem de çoğaltılan ürünleri saptama işleminin yapılabilmesi, bu yöntemi çok pratik bir yöntem haline getirmiştir.

3- Kontaminasyon riski oldukça düşüktür. Tüpler açılmadan test tamamlandığı için kontaminasyon riski de azalmaktadır.

4- Mutasyon çalışması yapılmak isteniyorsa floresans veren problar kullanılarak hedef nükleik asitteki mutasyonlar kolaylıkla saptanabilmektedir

5- Rekabet nedeniyle ucuzdur.

Elde Edilen Ürünlerin Varlığı Nasıl Anlaşılır?

Real-time PCR’da amplifikasyon sonrasında elde edilen ürün varlığının saptanması çeşitli şekillerde yapılabilir. Bunlardan birincisi özgül olmayan bir yöntem olan çift zincirli DNA boyalarının kullanılmasıdır. Bu amaçla en sık kullanılan boya SYBR Green I’dir. Primerlerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen polimerizasyon aşamasında hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan boya miktarı artar ve buna bağlı olarak yayılan floresans miktarında artış gözlenir. Elde edilen floresansın istenen hedef bölgenin amplifikasyonuyla mı gerçekleştiği, yoksa non-spesifik bir ürün mü olduğunu anlayabilmek için “melting curve” (erime eğrisi) analizi yapılır. Çoğaltılan hedefin özgül olarak saptanması amacıyla işaretli problar kullanılır. Prob formatları 7 arasında en sıklıkla FRET (Fluorescens Resonance Energy Transfer), Taqman ve Molecular Beacons yer almaktadır.

Real Time PCR’da Probların Önemi Nedir?

Aslında bu metodu geleneksel PCR yönteminden ayıran en önemli kriterlerden biri problardır. Bu nedenle özellikle uygun prob seçimi, real-time PCR işleminin verimliliğini etkileyen en önemli basamaklardan biridir. Probun işlevi, cihaz içerisinde gerçekleştirilmiş olan çoğaltma işleminin gözle görülür hale getirilmesidir. Prob kullanılmadan da, PCR tüpü içerisinde uygun primerlerin, dNTP’lerin ve enzimin kullanımıyla PCR işlemi gerçekleşecektir. Ancak prob kullanılmadan sonucun real-time PCR cihazının bilgisayarında görüntülenmesi mümkün olmayacaktır.

Elde Edilen Ürün Miktarı Nasıl Anlaşılır?

Real-time PCR’da oluşan ürün miktarı reaksiyon boyunca oluşan ürün miktarıyla orantılı olarak artan floresan boya ve probların verdiği sinyalin izlenmesiyle anlaşılır ve amplifikasyonun devir sayısı belirli miktardaki DNA moleküllerinin elde edilmesi açısında da gereklidir.