Elektroforez; moleküllerin elektrik yüklerine göre ayrılması tekniğine verilen isimdir. SDS-PAGE en yaygın kullanılan elektroforez çeşidi olup proteinlerin veya polipeptitlerin molekül ağılıklarına göre akrilamid jelde elektrik akımı etkisiyle hareket ettirilmesi ve sonunda jelde bunların tespit edilmesini sağlayan tekniktir.
Jel, akrilamid ve bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşur. Bu yöntem yalnızca proteinler için değil aynı zamanda DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılmaktadır.
Basit, hızlı ve en çok kullanılan yöntem olan bu yöntemin haricinde agaroz jel elektroforezi de çok kullanılır fakat bu yöntem proteinler için değil nükleik asitler içindir.
SDS-PAGE ayırma ve yığma jeli olmak üzere iki kısımdan oluşur. Buralarda kullanılan kimyasalların yüzdesi ve miktarı farklıdır. Bu kimyasallar nelerdir?
- Akrilamid; jel polimerinin monomeridir. Serbest radikal polimerizasyonu ile polimerize olur. Nörotoksik bir maddedir.
- N,N’-metilen-bis (akrilamid);çapraz bağlayıcı ajandır. Jelleşmeyi sağlar.
- Sodyum dodesil sülfat (SDS); proteinleri denatüre eder ve üç boyutlu yapılarını bozar ve protein doğrusal hale gelir.
- Tetrametilendiamin (TEMED); serbest radikalleri kararlı hale getirir.
- Amonyum persülfat (APS); serbest radikal kaynağıdır, jel oluşumunu başlatır.
- Gliserol; örneklere yoğunluk verir.
- β-merkaptoetanol; denatürasyona yardımcıdır, disülfit bağlarını kırar.
Ayrıca tris, brom timol mavisi, TCA (trikloroasetik asit), Coomassie G-250, asetik asit.
!!! Bu kimyasalların miktarlarını ve hazırlanışlarını bilimsel yayınlarda bulabilirsiniz.
SDS-PAGE işlemi şu şekilde yapılır; ilk önce cam plaklar iyice alkol ve saf su ile yıkanır ve kurutulur. (Cam üzerinde leke olmaması önemlidir aksi takdirde yürümede sıkıntı olabilir). Cam plakalar aparata yerleştirilir. Ayırma jeli hazırlandıktan hemen sonra ince bir pipet yardımıyla pipetlenir ve bunun üzerine jelin üstünün pürüzsüz olması için hemen izopropil alkol den bir miktar dökülür. Ayırma jeli polimerize oluncaya kadar beklenir sonra izopropil alkol dökülür ve saf su ile yıkanır. Jele temas etmeyecek şekilde bir kurutma kağıdı yardımıyla kurutulur. Yığma jeli hazırlanır ve ayırma jelinin üzerine dökülür ve tarak yerleştirilir. Polimerize olduktan sonra tarak çıkarılır. Tarakların kuyuları önce saf su ile sonra yürütme tamponu ile yıkanır ve elektroforez tankına yerleştirilir. Hazırlanan protein numuneleri numune tamponuyla birlikte kaynar suda inkübe edildikten sonra soğutulur ve bu kuyulara yüklenir. Tank kapağı kapatılarak elektroforez tankının alt ve üt kısmına yeterince yürütme tamponu konulur ve elektrik bağlantıları yapılır. Belirlenen süreye kadar yürütme gerçekleştirilir. Yürütme işlemi tamamlandıktan sonra jel aparattan ayrılarak boyama çözeltisinden çalkalama yöntemiyle bekletilir. Boyanan jel yıkama çözeltisine konulur ve çalkalanır, protein bantları iyice görülünceye kadar yıkama çözeltisinde yıkanır. Yıkama çözeltisinden çıkarıldıktan sonra ise görüntüleme cihazından görüntüsü elde edilir.
Hepsi bu kadar… değil:)) eğer görüntü çıkmazsa yapılan bütün işlemler çöpe… Görüntü elde edilinceye kadar aynı işlemlere kimyasalların miktarlarını değiştirerek deneme yanılma yoluyla en iyi sonucu elde edinceye kadar devam… Kısacası uzun zaman ve işgücü gerektiren bir yöntem…
