PCR Nedir?
Kary Mullis tarafından 1980’lerde geliştirilen devrimci bir yöntem olan PCR “polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction)” saflaştırılmış DNA polimerazları ve kimyasal olarak sentezlenmiş olan DNA oligonükleotidleri sayesinde özel olarak belirlenen bir DNA dizisinin canlı hücreye gerek kalmadan kopyalanması tekniğine verilen isimdir. PCR reaksiyonunun sonunda spesifik dizi milyarlarca kopya biriktirilebilir.
PCR için gereken reaktifler;
- Genomik DNA
- DNA oligonükleotidi
- Deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs)
- Taq DNA polimeraz
En basit haliyle, bir DNA numunesi ve bir DNA polimeraz, nükleotidler, primerler ve diğer reaktifler (yapay kimyasal bileşikler) bir numune tüpüne eklendiğinde reaksiyon oluşur. Reaktifler, DNA kodunu kopyalamak için gereken reaksiyonu kolaylaştırır.
PCR’yı başlatmadan önce, DNA örnekten izole edilmelidir. PCR temelde üç ana döngünün tekrarlarından oluşur bunlar nelerdir?
1- Denatürasyon( Denaturation): PCR’nin ilk adımı olan bu işlemde örnek DNA’yı içeren tüp, iki sarmallı DNA’yı iki ayrı ipliğe ayırır. Bu işlem 90 derecede gerçekleştirilir. Yüksek sıcaklık, DNA kodunu oluşturan nükleotidler arasındaki nispeten zayıf bağları kopartır. Sıcaklığın DNA zincirlerinin tamamen ayrıldığından emin olmak için bu aşamada yeterince uzun süre tutulması önemlidir. Bu genellikle 15-30 saniye sürer.
2- Eşleşme (Annealing): 40-60 derecede gerçekleşen bu adımda primerler tek iplikçik halindeki kalıp DNA’ya spesifik olarak bağlanırlar. Primerler DNA sentezinin başlangıç noktası olarak kullanılır. Polimeraz enzimi sadece DNA çift sarmalına DNA bazları ekleyebilir. Primer bağlandığında sadece polimeraz enzim bağlanabilir ve DNA’nın yeni tamamlayıcı zincirini gevşek DNA tabanından yapmaya başlar. Bu adım genellikle yaklaşık 10-30 saniye sürer.
3- Uzama (Extension): Bu aşamada sıcaklık yaklaşık 72 dereceye yükselir. Primerlerle işaretlenmiş bölgelerden başlayarak, çözeltideki nükleotidler Taq DNA polimeraz tarafından eşleşmiş primerlere eklenerek tekli şablon iplikçiklerinden her birine tamamlayıcı yeni bir DNA zinciri oluşturulur.
Bu aşamalardan denatürasyon ve uzama da ısılar değirmez fakat eşleşmede ısı istenen DNA dizisinin içeriğine göre değişir. DNA’nın PCR ile iki kopyasını yaptıktan sonra, tekrarlanan DNA kopyalanan DNA’yı kullanarak tekrar başlar. Her çift, iki yeni kopya oluşturur ve yaklaşık 30 veya 40 PCR devresinden sonra, orijinal DNA bölümünün bir milyardan fazla kopyası yapılmış olur. PCR işlemi otomatik olarak gerçekleştiği için sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir.
PCR tamamlandıktan sonra, üretilen DNA fragmanlarının miktar ve boyutlarını kontrol etmek için elektroforez denilen yöntem kullanılabilir.
