Gram Boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki büyük gruba (Gram-Pozitif, Gram-Negatif) ayırmak için kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu yöntemi bulan kişi, Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram‘dır. Bu yöntem, 1884 yılında, pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini ayırt edebilmek için geliştirmiştir.
Gram boyama tekniği, mikrobiyolojide sık kullanılan bir boyama yöntemi olup mikroorganizmaların sınıflandırılmasında ve tanımlanmasında kullanılır. Gram boyama ile bakteriler “gram pozitif” (gram olumlu) ve “gram negatif” (gram olumsuz) olarak ikiye ayrılır.
Gram boyama, enfeksiyon şüphesi olan vücut sıvılarında ve biyopsi örneklerine de uygulanır. Menenjit şüphesi olan Beyin omurilik sıvısı örneklerinde veya Septik artrit şüphesi olan eklem sıvısı örneklerinde uygulanabilen bu teknik, zamanın kısıtlı ve tedavinin acil olabileceği durumlarda, bazen günlerce beklemeye sebep olan kültür uygulamalarından çok daha çabuk sonuç verir.
Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar gram pozitiftir. Spiral şekilli bakteriler ise gram negatiftir. Gram pozitif bakterilere örnek olarak Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis verilebilir. Gram negatif bakterilere örnek olarak E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes verilebilir.
Gram boyama için hazırlanacak preparatlarda kullanılacak kültürlerin genç (18–24 saatlik) olması gerekir. Daha yaşlı kültürlerle çalışılması durumunda yanlış sonuçlar alınabilir. Gram (+) bakteriler de gram (–) gibi değerlendirilebilir.
Gram boyama yapmak için hazırlanmış preparatın üzerine kristal viyole boyası damlatılıp 1 dakika beklenir ve iyot-lugol çözeltisi ile yıkanarak kristal viyole uzaklaştırılır. Preparata tekrar iyot-lugol çözeltisi damlatılarak 1 – 2 dakika bekletilip, distile su ile yıkanarak iyot-lugol çözeltisi uzaklaştırılır. Preparatın üzerine %96 ‘lık etil alkol veya eter – aseton çözeltisi damlatılarak 15 – 30 saniye beklenir, distile su ile yıkanır ve karşıt boya olarak safranin damlatılır ve 40 – 50 saniye bekletilir. Preparat distile su ile yıkanarak havada kendi halinde kurumaya bırakılır, preparata immersiyon yağı damlatılır ve 100’lük objektifle incelenir. Mor renkli bakteriler Gram pozitif, pembe-kırmızı renkli bakteriler ise Gram negatif olarak değerlendirilir. Gram boyama için gerekli olan tüm çözeltiler hazır ticari kitler halinde de pazarlanmaktadır.
Gram boyanma özelliği bakteri hücre duvarının (çeperi) yapısı ile ilgilidir. Hücre duvar yapıları arasındaki farklar:
1- Gram (+) bakterilerin hücre çeperinde gram (–) bakterilere göre daha kalın peptidoglikan tabakası mevcuttur.
2- Gram (+) bakterilerin hücre çeperinde karbonhidratlar, gram (–) bakterilerin hücre çeperinde lipidler fazladır. Karbonhidratlar alkolle dekolarizasyon esnasında dehidratasyona (su molekülünün açığa çıkması) uğrar. Porlar iyice büzüşür, daralır ve boya dışarı çıkamaz. Lipitler de ise alkol çözücüdür ve hücre çeperinde olan porlar daha çok açılarak genişler.
3- Gram (+) hücre çeperinde teikoik asit olmasına rağmen gram (–) yoktur.
Gram Boyama Mekanizması
Gram-pozitif bakterilerin kristal viyole/iyot kompleksini tutma özelliğine sahip peptidoglikan yapıda hücre duvarları vardır. Hücre duvarlarının ağsı ve kat kat peptidoglikandan oluşan yapısı boya parçacıklarını tutar. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarı ise sadece ince bir peptidoglikan katmanında oluşur ve boyaları tutamaz. Gram-negatif bakterilerde aynı zamanda lipid yapıda bir dış zar duvardır.
Alkol, Gram-pozitif hücre duvarının su kaybedip büzüşmesine neden olur bu yüzden boya tanecikleri moleküllerin arasına sıkışır. Gram-negatif bakterilerdeki ince olan peptidoglikan katman boya parçalarını tutamaz; alkol dış zardaki lipitleri çözünce boya dağılır, hücrenin rengi açılır. Renk açılması adımı önemlidir ve belli bir yetenek gerektirir çünkü Gram-pozitif olma kesin bir sonuç vermeyebilir. Renk açılmasının ardından birinciden farklı ikinci bir boya (safranin or fuchsin) uygulanır, bu boya rengi açılmış hücreleri boyayarak onların görünmelerini sağlar. Gram pozitifler birinci boyayla mora boyandıkları için ikinci boya onların rengini etkilemez, ama Gram negatif olanlar pembe-kırmızı olurlar.
Genellikle (istisnalar mevcuttur), Gram-negatif bakteriler hastalık yapıcı kuvvetleri açısından daha tehlikelidirler. Gram-negatiflerin dış zarlarının üstünde, antikorların bağlanmasını engelleyen bir sümük tabakaları vardır. Bakterinin dışında kapsül bulunması da hastalık yapıcı etkinliğini arttıran (virülans) faktörlerdendir. Gram-negatif bakteriler bütün bunlara ek olarak, dış zarlarında lipopolisakkarit bulunur, bu yangının (enflamasyonun) artmasına neden olan bir endotoksindir. Yangı o derece şiddetli olabilir ki septik şok meydana gelebilir. Gram-pozitiflerin ise hücre duvarlarını koruyan dış zarları yoktur ve vücudun ürettiği lizozim enzimi çıplak peptidoglikan katmanlarına zarar vererek bakteriyi imha eder. Gram-pozitifler bu özellikleri yüzünden penisilin gibi beta-laktam antibiyotiklere daha duyarlıdırlar.
Kaynak:
- http://www.wikizero.info/
- http://www.megep.meb.gov.tr/?page=moduller (Boyama Yöntemleri)
